بررسی بیان ژن Real Time PCR

همانطور که از معنی واژه بر می آيد مفهوم Real-time PCR   مشاهده لحظه به لحظه فرايند تکثیر اسید نوکلئیک می باشد. مشکلات و نواقص عديده موجود در PCR های معمول همراه با نياز به يک روش تعيين کمی دقيق زمينه گشايش عرصه ای نوين در تکنيک PCR گرديد.

در این تکنیک از رنگهایی استفاده می شود که پس از اتصال به ساختار دو رشته ای DNA – ، نور فلورسانس منتشر می کنند. بنابراین در طی واکنش PCR، به موازات افزایش غلظت DNA، میزان فلورسانس در محلول افزایش می یابد.

با اندازه گیری شدت نور فلورسانس در انتهای هر سیکل، نهایتا یک منحنی بدست می آید. سپس با استفاده از نمودارهای استاندارد، غلظت DNA هدف در نمونه مورد مطالعه محاسبه می شوند. لازم به ذکر است که رنگهایی نظیر SYBER GREEN به تمام انواع DNA دو رشته ای، از جمله محصولات غیر اختصاصی PCR و حتی دایمرهای پرایمر (primer drimers) نیز متصل می شوند و این موضوع موجب کاهش اختصاصی بودن (Specificity) در نتایج حاصل می شود.

در تکنیک Real-time PCR، دقیقترین و قابل اعتماد ترین نتایج با استفاده از شاخص های گزارشگر ((Probe فلورسانس بدست می آید که البته هزینه زیادی نیز در بردارد. در این روش از شاخصهای DNA اختصاصی (sequence-specific DNA-based probe) استفاده می شود و در نتیجه در DNA هدف، جستجو و تعیین غلظت برای سکانسهای خاص امکانپذیر می شود. بنابراین حتی در حضور سایر انواع DNA، نتایج حاصل از نظر اختصاصی بودن، در حد بالائی است. در این شرایط، چنانچه از شاخصهای اختصاصی با رنگهای مختلف استفاده شود، حتی میتوان ژنهای متعددی را در یک واکنش PCR، مورد بررسی قرار داد.

مزاياي روشReal-time PCR:

1) تكثير در هر زمان قابل مشاهده مي باشد. به عبارتي امكان مانيتورينگ لحظه به لحظه واكنش فراهم آمده و در هر سيكل امكان بررسي فرآيند تكثير وجود دارد.

2) امكان قطع واكنش در زمان دلخواه: از آنجايي كه روند PCR قابل مشاهده است. درصورت عدم تكثير ويا رفتن به فاز سكون (Plateau) مي توان به واكنش خاتمه داده و از اتلاف وقت و انرژی پرهيز نمود.

3) انجام PCR كمي : با استفاده از روش Absolute Quantification و Relative Quantification ميزان دقيق و نسبي الگوي اوليه قابل اندازه گيري است.

4) معمولا˝واكنشها سريعتر اتفاق افتاده و زمان كمتري لازم است.

كاربردهاي Real-Time PCR :

1) بررسی بيان ژنها:  كاربرد وسيع آن در مورد بيان سايتوكاين هاي مختلف بخصوص در مورد بيماري هاي خود ايمني و پاتوژنهايي نظير ليشمانيا مي باشد.

2) Drug Therapy Efficacy:  براي اين منظور يك ژن خاص )البته اين ژن عامل بيماري نيست و بعنوان ماركر تلقي مي شود( درنظر گرفته شده و اثر داروي موردنظر بر تغييرات بيان اين ژن بررسي مي شود . تغيير بيان اين ژن نشان دهنده وضعيت درمانی می باشد.

3) بررسي ميزان بيان آنزيم هاي كبدي براي متابوليزه كردن داروي خاص: بطور كلي اثر داروها بر روی  آنزيم هاي كبدي به دو صورت است. گروهي بيان آنزيمهاي تجزيه كننده داروها را افزايش داده و گروه ديگر باعث مهاراين آنزيمها مي شوند. براي داروهاي دسته اول مقدار دارو درخون كاهش مي يابد و در نتيجه به دوز دارويي بالاتري نياز است ولي دردسته دوم دارو تجزيه نشده و در نتيجه مقدار كمتري دارو موردنياز است.

4) كابرد در جهت  شناسايي و تعيين  Load عوامل عفوني :حساسيت به مراتب بالای اين تکنيک  امکان تعيين ميزان دقيق  يک پاتوژن را  مهيا کرده است. تعيين ميزان دقيق  عواملی مثل HIVوHBV در درمان افراد آلوده دارای ارزش می باشد.

5) در سيستم هاي كنترل غذا و دارو براي  Food Safety: نمونه موردنظر از نظر ميزان آلودگي ميكروبي با نمونه كنترل مقايسه مي شود.

6) ژن درماني: در اين حالت براي تعيين دوز وكتورحاوی ژن مورد نظر در ژن درمانی يا Copy Number آن و ارزيابي اينكه وكتور وارد چه سلولها يا بافتي شده است از Real -Time PCR استفاده مي شود.

7) ژنوتايپينگ : متداولترين كاربرد آن تشخيص قبل از تولد، تشخيص قبل از لانه گزيني، تعيين  زيرمجموعه (subtype) ويروسها و باكتريها مي باشد. در ژنوتايپينگ از مدل اختصاصي (specific format) استفاده مي شود  که در صفحات بعدی توضيح داده خواهد شد…

8) تشخيص  پلي مورفيسم ناشي از جهش تك نوكلئوتيد  :(Single nucleotide Polymorphism)به جهش هاي نقطه اي در منطقه اي از ژن گفته مي شود كه بهترين ماركرهاي اختصاصي ژنتيكي در فرد است كه داراي پلي مورفيسم با فراواني حداقل 1% درجامعه مي باشند.تشخيص SNP  با استفاده از روش FRET probe  قابل انجام است( که بعدا˝ به تفصيل توضيح داده خواهد شد